Nguyên liệu và
phương pháp nghiên cứu
Các nòi nấm men nghiên cứu là Saccharomyces cerevisiae có nguồn gốc từ Tiệp Khắc, Đức nằm trong sưu tập giống của Viện Công nghiệp Thực phẩm
Môi trường sử dụng để sinh bào tử là acetat và lactat (Kovacova, 1983). Xác định dấu hiệu di truyền trên môi trường YPG với kháng sinh (Subik, 1972)
Lai ghép bào tử thực hiện trên máy vi thao tác Zeissov. Theo dõi khả năng lên men bằng tố độ thải CO2 (Castelli, 1954). Các chỉ tiêu hoá học của thành phẩm về chế độ cồn, axit, đường, SO2 xác định theo tiêu chuẩn Việt Nam.

III. Kết quả và bàn luận
1. Nghiên cứu nâng cao khả năng tạo bào tử của nòi nấm men Saccharomyces cerevisiae
Để tạo được nòi men rượu mới trước hết chúng tôi nghiên cứu tuyển chọn dòng thuần khiết của những bào tử đơn bội từ những nòi có khả năng tạo bào tử cao. Vấn đề tạo bào tử là một quá trình tổng hợp với sự điều khiển của nhiều gen và sự hoạt động của các gen được chi phối bởi các điều kiện bên ngoài cũng như các đặc tính sinh lý của chúng (Fowell, 1952, 1960,1969). Đa số các chủng nấm men dùng trong sản xuất công nghiệp thường tạo bào tử rất khó khăn và thường xảy ra ở những điều kiện đặc biệt. Bởi vậy chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu các loại môi trường thích hợp cùng với sự thay đổi thời gian và nhiệt độ nuôi cấy để nâng cao khả năng tạo bào từ của chúng. Kết quả được trình bày ở bảng 1.
Bảng 1 cho thấy khả năng tạo bào tử của 4 giống Sac.cerevisiae cùng với 21 bào tử phân lập đời 1 và 2, kết quả cho thấy các bào tử đơn sau khi phân lập chọn lọc, có khả năng tạo bào tử cao hơn các thế hệ đầu. Môi trường axetat thích hợp đối với quá trình tạo bào tử của men rượu vang hơn môi trường lactat. Nhiệt độ nuôi cấy 240C phù hợp cho sự sinh bào tử của đa số nấm men rượu vang. Nhiệt độ 300C tạo bào tử kém hơn bởi đây là nhiệt độ tối ưu kích thích sự sinh sản của tế bào bằng phương pháp nảy chồi. Với ảnh hưởng của nhiệt độ thấp kéo dài trong toàn bộ quá trình nuôi cấy (120C) đều hoàn toàn ức chế sự phát triển của tế bào cả về nảy chồi cũng như tạo bào tử.
Đồng thời chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy thấp đột ngột (70C) đến quá trình tạo bào tử của nấm men. Kết quả bảng 2 cho thấy rõ khả năng tạo bào tử của giống đã tăng lên rõ rệt ở thời gian nuôi cấy phù hợp với tác động nhiệt độ thấp là 70C trong thời gian 20 giờ.
Khả năng tạo bào tử của F1 tăng 16%, P5 tăng 15%, P6 tăng 27,5%, P6-H1 tăng 23%, 74F tăng 45%, B1 tăng 27% và đặc biệt P5-D1 tăng 66%. Đây là một kết quả hoàn toàn mới về khả năng sinh bào tử của nấm men rượu vang dưới tác động của nhiệt độ thấp phù hợp. Chúng tôi chuẩn đoán có lẽ ảnh hưởng này như là một tác nhân "sốc" dương tính đối với sinh lý của tế bào và những gen điều khiển tạo bào tử. Điều kiện tối ưu tạo bào tử của nấm men rượu vang đã được xác định trên môi trường nuôi cấy acetat, nhiệt độ nuôi cấy 240C trong 96 giờ và tác động "sốc" 70C - 20 giờ. Sáu cá thể có khả năng tạo bào tử đã được chọn lọc: P5-D1; 74F; F1;P6; P6-H1; B1.

2. Tuyển chọn những đột biến thể có đặc tính di truyền phù hợp
Để tuyển chọn những cá thể lai ghép mang đặc tính di truyền của cả bố lẫn mẹ thì cần thiết phải xác định các dấu hiệu di truyền của các cá thể đưa vào cặp lai. Chúng tôi xác định dấu hiệu di truyền của nấm men rượu vang dựa trên khả năng bền vững và nhạy cảm với một số kháng sinh như cloramfenicol, erytromyxin và muxidin. Quy trình thực hiện như sau: sáu cá thể trội có khả năng tạo bào tử cao là: P5-D1, 74F, F1, P6, P6-H1 và B1 được hoạt hoá trên môi trường tối ưu. Bằng phương pháp đóng dấu các tế bào được gieo cấy trên hộp lồng có chứa môi trường đặc hiệu YPG và có bổ sung từng loại kháng sinh. Dấu hiệu di truyền được xác định trên khả năng phát triển của giống thể hiện mang gen có tính bền vững với kháng sinh tương ứng (R), hoặc tế bào không phát triển thể hiện tính nhạy cảm với kháng sinh S'. Đặc tính di truyền với kháng sinh của nấm men chọn lọc được thể hiện ở bảng 3.
Kết quả cho thấy tất cả các nấm men khảo sát đều bền vững với cloramfenicol và nhạy cảm với muxidin, riêng đối với erytromyxin giống F1 thể hiện tính nhạy cảm (ERYS) khác hẳn tính kháng (ERYR) của 5 giống còn lại. Để có được con lai mang dấu hiệu di truyền đặc trưng thể hiện sự trao đổi chéo hai tính trạng gen đối lập, chúng tôi đã áp dụng phương pháp tuyển chọn thể đột biến tự nhiên ty lạp thể nhằm mục đích tìm ra những cá thể mang gen kháng muxidin. Quá trình tuyển chọn được thực hiện ở thế hệ thứ 3, từ 106 tế bào của dòng F1 một cá thể đột biến muxidin là F1-1-23-MUC đã được thu nhận. Đây là cá thể đột biến ty thể ngẫu nhiên duy nhất có thể đưa vào cặp lai với những cá thể có tính nhạy cảm với muxidin.

3. Lai ghép bào tử nấm men và chọn lọc
Năm giống có khả năng tạo bào tử cao là P6; P6-H1; F1; 74F;B1;D5-D1 được chọn lọc để lai ghép với đột biến thể ty thể F1-1-23-MUC theo phương pháp của Fowell (1955). Các cá thể lai được chọn lọc và kiểm tra đặc tính di truyền với erytromyxin và muxidin, kết quả cho thấy rõ từ 399 đôi bào tử đơn của 5 cặp lai, có 57 cá thể lai được thu nhận, nhưng chỉ có 4 cá thể lai điển hình thể hiện tính kháng muxidin và erytromycin, 53 cá thể lai không điển hình thể hiện tính kháng không đầy đủ (R") và nhạy cảm không hoàn toàn (s").

4. Kiểm tra khả năng lên men của cá thể lai
Năng lực lên men của các cá thể lai được khảo sát bằng trọng lượng CO2 (g/l) tạo ra trong quá trình lên men từ dịch nước quả 28% độ đường trong thời gian 15 ngày tại nhiệt độ 200C (h.1)
Kết quả cho thấy rõ, khả năng lên men bắt đầu sau 24 giờ và tăng rõ rệt từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 8. Trong 4 cá thể lai có 2 cá thể lai là K9 và K7 đạt tốc độ lên men mạnh hơn đối chứng, hàm lượng CO2 thoát ra đạt tới 115,53 và 115,09 g/l.
Các chỉ tiêu hoá học của thành
phẩm được phân tích sau quá trình lên men thực nghiệm ở quy mô 251, kết quả bảng 5 cho thấy rõ cá thể lai K9 và K7 tạo hàm lượng cồn cao nhất 14,44% w và 14,31% w trong khi đó cá thể ban đầu chỉ đạt 11,0% w và 12,0% w. Các chỉ tiêu khác như hàm lượng đường sót, hàm lượng axit đạt kết quả tốt hơn đối chứng. Sau quá trình chọn lọc và lai ghép đã tạo được chủng nấm men có khả năng lên men triệt để ở độ đường cao, đây là một thuận lợi để đạt hiệu quả kinh tế cao khi đưa nấm men áp dụng sản xuất công nghiệp.


IV. Kết luận
Kỹ thuật lai ghép bào tử đã được nghiên cứu thành công để tạo ra các nòi nấm men rượu vang Saccharomyces cerevisiae mới. Dựa trên cơ sở chọn lọc các đột biến ty thể tự nhiên có khả năng đề kháng muxidin và nghiên cứu tuyển chọn các nòi nấm men đồng tính có khả năng tạo bào tử cao trên môi trường axetat ở nhiệt độ 240C với ảnh hưởng của nhiệt độ sốc 70C trong thời gian là 20 giờ. 57 cá thể lai mới đã được thu nhận, trong đó chỉ có 4 cá thể mang dấu hiệu di truyền ty thể đặc trưng, 2 cá thể lai là F1-1-23-MUC x 74F (K9) và F1-1-23-MUC x B1 (K7) có khả năng lên men nhanh, tạo độ cồn cao, hàm lượng axit và SO2 thấp hơn chủng giống nấm men ban đầu.


V. Tài liệu tham khảo
1. Castelli T. (1954). Les agents de la fermentation vinaire. Arch. Mikrobiol 20: 323-343.
2. Eustace R. Thornton R.J. (1987). Selective hybridisation of wine yeasts for higher yield of glycerol. Can. J. Micobiol. 33, 112-117.
3. Fowell R.R. (1952). Sodium acetate agar as a sporulation medium for yeast. Reprinted from nature, vol. 170, 578.
4. Fowell R.R., Moorse Margaret E. (1960). Factors controling the sporulation of yeast. I. The presporulation phase. J. Bact. 23(1), 53-68.
5. Fowell R.R. (1969). Sporulation and hybridisation of yeasts. In A.H. Rase and J.S. Harrison. The yeasts. V.I.Acad. Press, In C. New York, 303-383.
6. Kovacova V. (1983). Geneticka analyza mikroorganizmov. Prirodovedecka fakulta UK Bratislava, 66.
7. Hara S., Hmura I., Otsuka K. (1980). Breeding usefull killer wine yeasts. Am. J. Enol. Vitis 31, 28-33.
8. Legman R., Margalith P. (1986). Ethanol formation by hybrid yeasts. Appl. Microbiol. Biotechnol. 23, 198-202.
9. Lindegren C.C. and Lindegren (1943). Anew method for hybridizing yeast. Proc. Nat. Sci. USA. 29, 306-308.
10. Mosiavili G.J, Salutasvili I.D. (1971). Gibridy drozzej dla vinodelija. Vinodel. Vinohrad. 3L, 19-21.
11. Romano P. and et at. (1985). Improvement of wine Sac. cerevisae strain by a breeding programe. Appl. and enviro. microbiology. Vol. 50, N4, 1064-1067.
12. Russell I. and Stewart G.G.(1979). Spheroplast fusion of brewer yeast strains. J.Inst. Brew. 85, 95-98.
13. Subik J., Kovacova V. Takasova G. (1977). Isolation characterisation and mitochondrial mucidin-resistant mutants of Sac. cerevisae. Biochem. 73, 255-286.
14. Takano I. and Oshima Y. (1970). Allelism test among various homothallism contronlling genes and gene system in Sacch.
Genetic, 64, 239-238.
15. Thornton R.J., Eschenbruch R. (1976). homothallism in wine yeast. J. Antonie van Leeuwenhoek, 42, 503-509.
16. Thornton R.J. (1982). Selective hybridisation of pure culture wine yeasts. H. Improvement of fermentation efficiency and inheritance of SO2 tolerance. Eu.J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 14, 159-194.
17. Thornton R.J. (1985). The introdution of flocculation in to a homothallic wine yeast. Am. J. Enol. vitic, 36(1), 47.
18. Winger O. and Laustsen O. (1938). Artificial Species hybridisation in yeast. CR. Trav. Lab. Carsberg Ser. Physiol. 22, 235-244.


Summary

The hybridization of wine yeast Saccharomyces cerevisiae
Dr. Truong Thi Hoa,
M.Sc Nguyen Thu Ha,
BSc. Pham Anh Tuan
Hybridization technique by spore conjugation has been used to develope new wine yeast strains of Saccharomyces cerevisiae. Based on selection of mitochondrial mutant of mucidin resistance and homothalic strains with high sporulating frequency in Acetate medium at 240C with influence of "shock" at 70C for 20 hour, 57 hybrids were isolated. These hybrids were investigated and tested genetic mitochondrial markers, 4 of them expressed typical genetic character of hybrids. The result shows that, two hybrids of wine yeast strains (F1-1-23-MUC x 74F and F1-1-23-MUC x B1) with high fermentation efficiency, high ethanol production and low level of acidity, SO2 were obtained./.